ANÁLISIS DE ALCOHOL EN SANGRE MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE GASES

La cromatografía gaseosa, con detector de ionización de llama en su variante técnica denominada espacio-cabeza (head space), resulta hoy el método más apropiado para la valoración de etanol en fluidos biológicos, especialmente sangre o plasma.

Este método, muy sensible, versátil, de excelente precisión y exactitud, es el más utilizado en el mundo. Esto permite la íntercomparación de resultados a través de ejercicios de control de calidad.

Las aplicaciones más corrientes las constituyen la medición de la alcoholemia en el instante de la toma de muestra o bien la determinación de la alcoholemia retrospectiva, que permite el cálculo del nivel de impregnación de alcohol “n” horas o minutos anteriores a la toma de muestra.

Por otro lado, su exacta determinación permite inferir procesos en los cuales pueden formarse o perderse alcohol post toma de muestra. 

Procedimiento de separación

Cada muestra de sangre u otro fluido disponible se preparan, previa agitación para homogeneizar, colocándose en un frasco de vidrio de 10 ml de capacidad perfectamente limpio, agregándose:

-1 ml de sangre entera.

-1 ml de n-propanol 1g. %0, (o preferentemente Pert- butanol para muestras postmortem como estándar interno)

-1 ml de solución saturada de K2 CO3, como agente liberante.

A continuación se precinta el tapón de goma colocado como cierre del recipiente, y sellado herméticamente con precinto de aluminio. Posteriormente se coloca durante 30 minutos en un baño termostático a 50ºC y a continuación se deja enfriar a temperatura ambiente.

Se tomaron entonces entre 0.4 y 0.5 ml del aire confinado (que lleva el etanol/metanol) en el recipiente mediante una jeringa hipodérmica plástica de 1 ml de capacidad que luego serán inyectadas en el cromatógrafo.

La cromatografía gaseosa es una técnica que ha revolucionado la separación y el análisis químico. Es una herramienta analítica que puede ser usada para el análisis directo de muestras gaseosas, soluciones líquidas o sólidos volátiles. En nuestro caso la muestra es líquida (la sangre) y el etanol/metanol es volátil (para ello calentamos la sangre).

Se realiza la separación de estos compuestos de la sangre para optimizar su determinación en el análisis.

Instrumental

Un instrumento para cromatografía gaseosa puede representarse por el siguiente esquema: 
 

El gas portador (fase móvil) proviene de cilindros provistos de válvulas reductoras. La muestra se introduce en el inyector con una microjeringa a través de un septum de goma. Allí se produce la vaporización instantánea de la muestra y su introducción en la corriente de gas. La columna se halla dentro de un horno que permite variar su temperatura y es el lugar en donde se produce la separación de los componentes de la muestra. El detector produce una señal eléctrica proporcional a la cantidad de materia a medida que cada componente separado pasa a través de él. Esa señal es enviada al registrador que realiza un gráfico de intensidad en función del tiempo (cromatograma).

En nuestro caso el equipo utilizado es un Cromatógrafo Gaseoso Shimadzu GC-14 conectado a un integrador CR4A, columna de acero inoxidable (2 m de longitud, 3 mm de diámetro interno) empacada con 0.3% Carbowax 1500-graphapack 60/80 (EMQ-ALL TECH), isotérmica 100ºC, detector de ionización de llama (FID) conectado a un integrador Shimadzu C-R4A. 

Se realiza una curva de calibración. 

Las condiciones de trabajo son las siguientes: Temperatura inicial 35°C, 1 minuto y 10°C/min de gradiente hasta 100°C temperatura final; siendo la temperatura de inyección y detector de 150 °C.

El método permite obtener señales definidas reproducible a valores bajos de tr (tiempos de retención) cercanos a los 2 min en las condiciones de ensayo señaladas, con buena separación del estándar interno

Los valores de área obtenidos en la inyección de los distintos estándares, se utilizan para la calibración y el ajuste de la curva.

Curva de calibrado

Se realizan varios cromatogramas, y a cada uno se le calcula la recta de regresión por el método de los mínimos cuadrados. La Selección de la mejor recta de calibrado se realiza teniendo en cuenta la ecuación de una recta, Ψ que expresa los parámetros F1 y F2 en función de las áreas del patrón y el estándar interno. Además, la elección de la mejor curva de calibración se basa en la comparación de las gráficas obtenidas y de los coeficientes de regresión (r2).

Se describe la ecuación de F2 en función de las áreas y las concentraciones del patrón y del estándar interno. Se obtiene entonces, la ecuación de una recta que tiene a F1 y F2 como pendiente y ordenada al origen.

De modo que en una gráfica de A patrón/A stand int. Vs. C patrón/C stand int obtenemos:

F1/F2 ordenada de origen

1/ F1 pendiente = sensibilidad

Límite de detección y límite de cuantificación

límite de detección: Yb + 3Sb

límite de cuantificación: Yb + 10Sb

Donde:

- Yb: Media de las señales obtenidas.

- Sb: Desviación estándar de las señales obtenidas.