ANÁLISIS MULTIELEMENTAL DE PESTICIDAS EN ALIMENTOS
– LABORATORIO AGROALIMENTARIO DE ARAGÓN
El empleo
de pesticidas en la agricultura esta regulado mediante los siguientes
reglamentos europeos:
En el primero se “fijan a escala
comunitaria los límites máximos de residuos (LMR)
en productos de origen vegetal y animal, teniendo en
cuenta las buenas prácticas agrícolas”. En el segundo se añade un anexo con la
lista de alimentos y piensos a los que deben aplicar dichos límites. En el
tercero se establecen las listas con los valores máximos de pesticida que puede
contener cada alimento.
Para velar
por el cumplimiento de ambos preceptos en el área de fitosanitarios se analizan
frutas, hortalizas, cereales, alimentos infantiles e incluso hojas y suelos
cercanos a la zona de cultivo en busca de residuos de más de 140 pesticidas
distintos.
La
calidad y veracidad de los resultados analíticos cobra una especial importancia en este tipo de análisis ya que si se produce
un positivo por pesticida el agricultor se enfrenta a la retirada de toda la
producción así como sanciones económicas y legales. Es por ello que el laboratorio agroalimentario esta oficialmente autorizado para la determinación
de plaguicidas en piensos y alimentos, y sus métodos están validados.
1. RECEPCIÓN DE LA MUESTRA
El
agricultor o los inspectores de sanidad traen las muestras, seleccionadas siguiendo
un protocolo de muestreo adecuado. Las muestras se dividen en 3 bolsas y se
etiquetan con el mismo código de barras y se precintan.
- Muestra 1: Con ella se sigue el método analítico
que veremos mas adelante.
- Muestra 2: Se congela y se guarda ya que si
hubiera un positivo se realizaría un contraanálisis.
- Muestra 3: Se la queda el agricultor y si esta
disconforme con los resultados puede solicitar un tercer análisis.
2. OBTENCIÓN DE LOS DATOS
Los métodos analíticos para la
detección de residuos de plaguicidas en alimentos se basan generalmente en
separación cromatográfica y se trata de métodos que requieren de una
instrumentación cara y compleja. Los ensayos analíticos basados en
cromatografía requieren de una preparación de muestra compleja para extraer las
materias activas del producto a analizar, empleando además disolventes
orgánicos contaminantes y deben ser llevados a cabo por personal cualificado.
La principal ventaja que tiene este tipo de ensayos es la posibilidad de medir
simultáneamente la presencia de diferentes plaguicidas, a lo que se conoce como
análisis multirresiduo.
La cromatografía
de gases (GC) es
la técnica más ampliamente empleada para el análisis multiresidual de
plaguicidas, siendo capaz de conseguir límites de detección muy bajos (μg/l -
ng/l). Muchos métodos oficiales de análisis están basados en esta técnica,
empleando como detectores el de nitrógeno y fósforo (NPD), de captura
electrónica (ECD), de ionización de llama (FID) o de espectrometría de masas
(MS).
Para el análisis de compuestos de alto peso molecular, altamente
polares o térmicamente lábiles, se emplea la cromatografía
líquida de alta resolución (HPLC),
que ha ido ganando terreno especialmente con el acoplamiento a un espectrómetro
de masas.
Cada
muestra que llega al laboratorio se
divide en dos porciones que siguen métodos distintos:
2.1 MULTIRESIDUOS:
MÉTODO QUECHERS (CG-MS, CG-ECD-NPD Y HPLC-MS)
El
método QuEChERS (Quick,
Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe) es uno de los mas utilizados para
realizar análisis multiresiduos de pesticidas en alimentos. Es un proceso de dos
etapas:
a)
Extracción: Las muestras se trituran congeladas. En el caso de
matrices con poco agua, como pueden ser los cereales, se añade hielo. Se toman 10 gramos del triturado
se añade TPP (patrón interno) y acetonitrilo y se agita durante un minuto. A
continuación se añade una mezcla de sales (4 g Magnesium sulphate anhydrous, 1 g Sodium chloride, 1 g Trisodium citrate dihydrate
y 0.5 g Disodium hydrogencitrate sesquihydrate) y
se agita de nuevo otro minuto. Las sales tamponan el pH entre 5- 5’5, este
rango es el mas favorable para la extracción cuantitativa de la mayoría de los
pesticidas. Por ultimo se centrifuga.
b)
Limpieza: Se trasvasa un volumen del sobrenadante a un tubo
con sulfato de magnesio y PSA. Se agita durante 30 segundos y se centrifuga.
Para muestras con un alto contenido en clorofila como pueden ser hojas, lechuga
etc. Además de PSA se emplea GCB (Graphitized Carbon Black) y se
aumenta el tiempo de extracción a 2 minutos. Se toma de nuevo 1 ml del
sobrenadante y se evapora bajo corriente
de N2 en el vial, reconstituyéndolo con metanol.
Los patrones para
dibujar las rectas de calibrado se preparan partiendo de una matriz que sabemos
que esta exenta de pesticidas, siguiendo todo el método como si fuera una muestra, y añadiéndole al final el estándar
interno (TPP) y una mezcla de pesticidas en concentración conocida.
En todos los casos la inyección tanto de la muestra como
de los patrones se hace de manera automatizada mediante el uso de
Para cada
muestra que llega al departamento se buscan cerca de 140 pesticidas distintos.
Dependiendo la volatilidad y la polaridad del pesticida se emplea uno de los
siguientes 3 sistemas de detección:
- CG-MS (ION TRAP)
Se
detectan cerca de 80 pesticidas, los mas volátiles y menos polares. La ionización
se realiza con electrospray. En la columna se separan por tiempo de retención y
en la trampa de iones se escogen los iones padre y se generan los hijos. El ion
trap tiene muchas ventajas (mejor sensibilidad, uso con fines estructurales,
MS-MS-MS…) pero también inconvenientes, como el de no poder analizar mas de 5
pesticidas en cada segmento de tiempo. Esto se debe a que el instrumento
necesita un determinado tiempo para tomar los puntos que unidos formaran la
señal de cada pesticida. En cada segmento se buscan 5 transiciones (pesticida
1, 2, 3, 4 y 5) a ciclos. Mientras el equipo busca la transición del pesticida
1 no puede buscar las transiciones de los demás, por lo que pierde información
a la hora de “dibujar” ese pico. Ese tiempo se conoce como Dwell Time a mayor numero de transiciones menor Dwell Time. Cada pico debe estar formando como mínimo por 8
puntos. El solapamiento de picos que salen en tiempos de retención muy cercanos
no es inconveniente porque cada transición se recoge por un canal diferente.
Otro
problema que tiene es la formación de aductos con sodio. Los iones se vuelven
neutros y se pierde sensibilidad. Para evitarlo la fase móvil (metanol/agua) es
muy pura, sin sodio ni potasio.
La trampa
de iones por ultimo no nos da pico de confirmación, sino que la comparación se
hace con los espectros de la biblioteca del procesador de datos. Si quisiéramos
confirmar algún positivo tendríamos que ir a la siguiente técnica analítica.
- HPLC-MS (TRIPLE CUADRUPOLO)
Los 40
pesticidas más polares y menos volátiles se detectan en el HPLC-MS. Antes de
cada uso se realiza una puesta a punto del instrumento. Primero se limpia la
cámara de l electrospray con una
mezcla metanol/agua. La cámara es lo que mas se “ensucia” del instrumento pues
en ella confluyen fase móvil, gas portador y secador y analitos. A continuación
se purgan siempre las bombas poniendo un caudal alto para arrastrar las
burbujas y limpiar la columna.
Las
bombas impulsan la fase móvil, la muestra se introduce entre dos fracciones de
fase móvil y entra en un loop donde se mezclan. De allí entran a la columna
donde se van separando. La salida de la columna va a parar al electrospray
donde se generan los iones que entran en el primer cuadrupolo (selección del
ion padre). En el hexapolo o celda de colisión es donde se produce la
fragmentación del precursor en hijos. El cuadrupolo 3 selecciona solo aquellos
fragmentos que nos interesan. De aquí llegan al detector (fotomultiplicador).
·
CG-ECD-NPD
Se
analizan unos 20 pesticidas, entre ellos el captan y el folpet, pesticidas con
una rápida degradación y que no se cuantifican bien en el CG-MS. También los
que tienen halógenos en su composición.
TRATAMIENTO DE LOS DATOS MÉTODO QUECHERS
Una vez
que tenemos los cromatogramas de las muestras, los patrones y los controles de
calidad el tratamiento de los datos
es similar en los 3 casos. Primero se crean las rectas de calibrado. Hay una
recta de calibrado por cada pesticida, por tanto en el CG-MS tendremos 80
rectas de calibrado. Cada una de estas rectas tiene que tener un buen R2,
un RSD de respuesta menor del 20% y que la verificación no se desvíe en más de
un 30%.
A
continuación se procesan los picos de cada muestra comparándolos con los que
hay en la biblioteca del ordenador para ver si alguno coincide. La confirmación
se produce si se cumplen ciertos requisitos:
ambos tienen el mismo tiempo de retención, el mismo padre, los mismos hijos y
el mismo ion ratio (proporción entre los fragmentos hijos). Además hay que
fijarse en la relación S/R y que las recuperaciones estén comprendidas entre el
70-120%. Así pues para cada muestra nos encontraremos con una lista con todos
los pesticidas y una de esta situación:
- Identificado: la muestra da señal, la señal
cumple todos los requisitos, interpolación sobre la recta de calibrado de
dicho pesticida à
concentración. ¿Supera el límite de cuantificación? ¿Supera el límite
máximo de residuo permitido?
- Failed: la muestra da señal, la señal no
cumple todos los requisitos.
- Missing: la muestra no da señal, no hay
interpolación.
2.2 DITIOCARBAMATOS
Los
ditiocarbamatos son fungicidas. Se acumulan sobre todo en la piel de la fruta.
La muestra se trocea, nunca se tritura pues los pesticidas entrarían en
contacto con las enzimas naturales que se encuentran en el interior de las
células. A continuación se trata la muestra en medio ácido y reductor,
calentándola, transformando los ditiocarbamatos en disulfuro de carbono que se
recoge en una capa de isooctano.
La
determinación del disulfuro de carbono se realiza mediante CG- pFPD (Detector fotométrico de llama pulsado). El
detector fotométrico de llama pulsado mejora la relación señal/ruido con
respecto a los habituales y es específico para la determinación de compuestos
azufrados. La llama se enciende y apaga en intervalos muy cortos de tiempo,
coincidiendo la medida cuando la llama se encuentra apagada, eliminado las
interferencias de los hidrocarburos. La señal disminuye, pero el ruido lo hace
en mayor proporción, mejorando la relación S/R.
3. FUTURO
Una alternativa a los métodos de
separación son los inmunoensayos. Un inmunoensayo es un test bioquímico en el que se
mide la concentración de una sustancia en un medio biológico basándose en la
reacción de un anticuerpo a un antígeno. La ventaja de los anticuerpos en su
elevada afinidad al antígeno en cuestión.
Los ensayos ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) son un tipo
de inmunoensayo en el que se realizan simultáneamente numerosas determinaciones
en una placa de 96 celdas o pocillos. Existen numerosos kits ELISA para
detectar la presencia de plaguicidas, y se trata de un procedimiento muy
adecuado para controlar la presencia de un residuo en muchas muestras. Sin
embargo, requiere de personal altamente cualificado y de un laboratorio bien
acondicionado para obtener una buena reproducibilidad.
Otro sistema rápido disponible en la actualidad es el biosensor. Se trata de un
instrumento de medida, basado en un elemento biológico capaz de interactuar con
el analito problema, que genera una señal eléctrica proporcional a la
concentración de la sustancia problema. Existen numerosos biosensores aplicados
a diferentes sectores, pero en lo que se refiere a la detección de plaguicidas,
apenas existe un dispositivo comercialmente disponible a nivel europeo. Sin
embargo, en la actualidad existen numerosos grupos de investigación y empresas
de alta tecnología desarrollando biosensores rápidos y sencillos capaces de
detectar la presencia de varios plaguicidas simultáneamente.
Las posibilidades de los biosensores
como método rápido de medida, económico, automatizado y sencillo de utilizar,
auguran una amplia utilización en el futuro, especialmente para su uso como
método de control rápido tanto en campo como en la industria procesadora que
aplica tratamientos postcosecha para alargar la vida útil de los productos de
origen agrícola.
Gracias al nuevo marco regulatorio europeo que por primera vez ha
armonizado los criterios de aplicación de plaguicidas entre los 25 estados
miembros, un dispositivo desarrollado para detectar un plaguicida en una
cantidad determinada, por primera vez será válido en cada uno de los estados
miembros.
En cualquier caso, es necesario avanzar en algunos aspectos
relevantes que se detallan a continuación:
- Homogeneizar
las materias activas empleadas en los diferentes países miembros de la
Unión Europea, de modo que se emplee un menor número de plaguicidas pero a
mayor escala. Al mismo tiempo, armonizar los criterios de aplicación de
plaguicidas con otros mercados, como por ejemplo el americano.
- Desarrollar
biosensores pequeños y portátiles que permitan su utilización tanto en
campo o en una planta agroindustrial.
- Desarrollar
sistemas multianalito que sean capaces de detectar la presencia de más de
un único plaguicida.
- Reducir
los costes por ensayo o determinación a unos pocos euros.
- Crear
y potenciar una red formada por fabricantes de biosensores, grupos de
investigación y empresas de distribución de reactivos y materiales.
- Validar
los nuevos instrumentos y técnicas para que sus resultados sean
comparables a los que se obtienen con las técnicas analíticas de
referencia.
4. BIBLIOGRAFIA
DUNE
INDRA PRAT BARBERAN
MASTER
DE QUIMICA SOSTENIBLE 2012
DISEÑO
Y CONTROL DE PROCESOS
